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东南大学赵远锦教授团队:液滴微流控制备分层反蛋白石多孔支架用于3D 细胞共培养

生物医学    2021-11-18 10:05

三维细胞培养具有更好地模拟天然组织特异性的优势,在药物开发、毒性检测和组织工程等方面发挥着重要作用。然而,现有的三维细胞培养支架或微载体往往尺寸有限,在模拟活体血管复合体方面表现不佳。

 

 

基于此,东南大学赵远锦教授团队提出了一种新型的分层反蛋白石多孔支架,通过简单的微流体方法来促进3D细胞共培养技术。设计的支架使用了包括乳液滴模板和惰性聚合物聚合的组合概念。研究表明,所制备的支架在细胞培养过程中保证了充足的营养供应,从而实现了细胞的大容量培养。此外,通过在支架中连续种植不同的细胞,可以建立内皮细胞包裹肝细胞的3D共培养系统,构建一定的功能组织。此外,用于共培养系统的支架的使用有助于肝细胞维持特定的体内功能。这些层次化的反蛋白石支架为3D细胞培养甚至仿生组织的构建奠定了基础。相关研究内容以“Hierarchically Inverse Opal Porous Scaffolds from Droplet Microfluidics for Biomimetic 3D Cell Co-Culture”发表于期刊《Engineering》上。

 

 

图 1. (a) 分层反蛋白石多孔支架的制造和 (b) 3D 细胞共培养的示意图。GelMA:甲基丙烯酸明胶;PEO:聚(环氧乙烷);HUVECs:人脐静脉内皮细胞;HepG2:肝癌

 

在实验中,以微流控产生的水包油(O/W)单乳液液滴为模板,制备了分层反蛋白石支架,如图1所示。选择GelMA和PEO的混合物作为层次反蛋白石支架的骨架材料。GelMA是一种生物相容性水凝胶,在三维细胞培养和组织工程等领域有着广泛的应用。同样,由于PEO的生物相容性、惰性和易于修饰,常被用作水凝胶支架制备中的致孔剂。基于这些背景,研究者通过在微流控装置中使用 GelMA 和 PEO 的混合物,然后去除 PEO 组分以制造分层多孔结构来制造分层反蛋白石支架。

 

 

图 2. 通过微流控技术生成的液滴模板。(a) 具有不同内相流速的液滴的在线生成图像(比例尺:500 μm)。(b) 液滴直径和流速之间的关系 (n = 3) (F1: 外相流速, 黑色方块; F2: 内相流速, 红色三角形)。(c) 自组装液滴模板(比例尺:200 μm)。(d) 液滴的尺寸分布(变异系数为 4.35%)。

 

在实验中,我们将玻璃管同轴组装在一个玻璃载玻片上,制成了一个玻璃微流控装置。内毛细管用于引入分散相(如甲基硅油),外毛细管用于引入连续相(如GelMA与PEO溶液的混合物),最外方形毛细管用于记录液滴在线生成过程。如图2(a)所示,甲基硅油在内管出口处被GelMA/PEO溶液乳化成液滴。通过调节两相溶液的流速,可以控制产生的液滴大小和支架对应的孔径。结果表明,随着弥散相速率的增加,液滴直径明显增大,而连续相速率与液滴直径呈相反关系(图2(b))。

 

如图2(c)和(d)所示,生成的液滴尺寸均匀,球形度好,单分散性高,是制备反蛋白石支架的理想模板。液滴组装成六角形紧密排列后,再将凝胶预凝胶溶液聚合,通过正己烷和乙醇洗去油相,最终得到了分层反蛋白石支架的第一个层次结构(即均质大孔结构)。

 

 

图 3. 分层反蛋白石多孔支架的结构。(a) 支架第一层次结构的光学显微镜图片。(b) 支架第一层次结构的 SEM 图像。(c) GelMA/PEO 水凝胶二级结构的 3D 重建荧光图像。(d) GelMA/PEO 水凝胶二级结构的 SEM 图像。(部分 (a)–(d) 中的比例尺分别为 200、200、100 和 10 μm。)

 

图 4.(a-d)分别在第 7 天和第 15 天在(a、b)GelMA 和(c、d)GelMA/PEO 支架中生长的 HUVEC 的 CLSM 荧光图像的 3D 重建(比例尺:200 μm)。( e )通过 MTT 测定确定在 GelMA 和 GelMA/PEO 支架中培养的 HUVEC 的增殖概况。

 

图 5. 在 GelMA/PEO 支架中培养的 HUVEC 在(a)第 1 天、(b)第 3 天和(c)第 7 天的 CLSM 图像:(i)荧光图像; (ii) 明场图像; (iii) 合并图像(比例尺:200 μm)。

 

图 6. (a) GelMA/PEO 支架中含有 HUVECs(红色)和 HepG2 细胞(绿色)的细胞共培养系统在培养 7 天后的 CLSM 图像:(i)HUVECs;(ii) HepG2 细胞;(iii) 合并图像;(iv) 侧视图(比例尺:100 μm)。(b)在 GelMA 和 GelMA/PEO 支架中与 HUVEC 共培养的 HepG2 细胞的白蛋白分泌和(c)CYP450 表达(*p < 0.05,**p < 0.01,n = 3)。

 

总之,研究者提出了一种分层反蛋白石支架,通过简单的微流体方法促进 3D 细胞培养。 支架是使用涉及乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的复合概念构建的。结果表明,所设计的支架保证了细胞增殖过程中充足的营养供应,从而实现了大容量细胞培养。此外,通过在支架中连续接种不同的细胞,开发了一种新的内皮细胞包裹的肝细胞 3D 共培养系统,用于构建某些功能组织。这种共培养系统促进了更高水平的白蛋白和CYP450的分泌,这表明支架中的共培养系统可以帮助维持肝细胞的活性和功能。最后,作者期望本研究设计的支架将为体外类器官的构建提供新的思路,并最终使组织工程受益。